若是新柱子，在使用之前，不要接检测器，用相应的溶剂多冲洗一会，防止柱子中有东西破坏或污染检测器，有时候柱子中有残留，或者是杂质，进入检测器比较麻烦。
补充：一般情况下不选择丙酮和乙醇作流动相，原因如下
1、丙酮由于碳氧双键的存在，紫外吸收比较强烈。
2、乙醇的黏度相对较大，以水作1，乙醇一点二、丙酮零点三二、 甲醇零点六零、 乙腈零点三七。
3、丙酮溶解性较高，单独使用对液路系统腐蚀性比较大。
如何使用反相柱
搜百度:反相柱（reversed
phase
column）：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。
在反相柱中C18（Octadecylsilyl，简称ODS），即十八烷基硅烷键合硅胶填料，这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了CH、C3、C4等短链烷基键合相和大孔硅胶（20～40μm）。使用反相柱要看样品的。细长柱虽然理论上塔板数多，柱效可能高点，但因为流速慢，因为扩散问题，分离效果也不见得就比短粗柱高，因为短粗柱流速高，色谱带薄（相当于谱峰展宽小），也可以达到很好效果。不过还是要看你样品性质和你的冲柱速度了.一般都使用短粗柱，这样效率较高
有关常压反相硅胶柱的使用注意事项。
C18反相硅胶的预处理很简单，就是用甲醇浸泡即可。使用的时候，将C18
反相硅胶用甲醇混匀，搅拌，可以稍微超声脱气泡但不可时间太长，5分钟吧。然后匀浆装柱，用甲醇冲洗柱子2-3个柱体积，将C18中的交联剂之类洗掉，然后用你的洗脱剂冲洗主子2-3个柱体积。洗脱剂的选择可以根据液相也可以根据反相板。如果根据液相的话，需要将液相条件中的有机相减小10%作为洗脱剂为好。然后将你的带分离物质用洗脱剂溶解，上样，加洗脱剂冲就可以了。反相硅胶可以反复使用，使用次数增多以后，有可能在柱子顶端产生颜色很深的色带，可以选择用丙酮冲洗，如果洗不掉可以选择将其挖去，然后将主子内C18硅胶保存在甲醇中即可。注意不要甲醇干了。
解释用反相柱测定咖啡因的原理
反相色谱法中流动相的极性大于固定相。
反相色谱法中流动相的极性大于固定相，利用各组分的咖啡因在色谱柱中固定相和流动相之间分配系数或吸附系数的差异，将各组分咖啡因分离后进行检测，并根据各组分咖啡因的保留时间和响应值进行定性、定量分析。
咖啡因，是一种黄嘌呤生物碱化合物，是一种中枢神经兴奋剂，能够暂时的驱走睡意并恢复精力，临床上用于昏迷复苏。
反向过柱子原理
溶质极性不同。在化学领域中，反向过柱子是反向柱层析分离的通俗叫法。反相柱的原理是利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性的差别进行溶质分离与纯化的洗脱色谱法。反向柱层析分离得出的柱色谱分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、电泳色谱、气相色谱等。
正相色谱柱和反相色谱柱的适用范围？
反相柱用于大多数HPLC分析，主要用来做含量分析。
正相柱主要用于分离手性化合物，主要用于测试ee值，dr值等。
前者流动相一般为与水混溶的溶剂，如水-甲醇，乙腈，甚至加入无机盐配成缓冲溶液，而后者往往用正戊烷等憎水溶剂。正相柱对溶剂中的水有一定要求，过多的水会使其损坏。
